Dziennik Ustaw - rok 2004 nr 73 poz. 663

Na podstawie art. 34 pkt 2 ustawy z dnia 21 grudnia 2000 r. o jakości handlowej artykułów rolno-spożywczych (Dz. U. z 2001 r. Nr 5, poz. 44, z późn. zm.³⁾ zarządza się, co następuje:

Minister Rolnictwa i Rozwoju Wsi: W. Olejniczak

¹⁾ Minister Rolnictwa i Rozwoju Wsi kieruje działem administracji rządowej – rynki rolne, na podstawie § 1 ust. 2 pkt 3 rozporządzenia Prezesa Rady Ministrów z dnia 29 marca 2002 r. w sprawie szczegółowego zakresu działania Ministra Rolnictwa i Rozwoju Wsi (Dz. U. Nr 32, poz. 305).

²⁾ Przepisy niniejszego rozporządzenia częściowo wdrażają Dyrektywę Komisji 80/891/EWG z dnia 25 lipca 1980 r. odnoszącą się do wspólnotowej metody analizy w celu określania zawartości kwasu erukowego w olejach i tłuszczach przeznaczonych do spożycia przez ludzi oraz w środkach spożywczych zawierających dodatek olejów i tłuszczów. Dane dotyczące ogłoszenia aktów prawa Unii Europejskiej, zamieszczone w niniejszym rozporządzeniu, z dniem uzyskania przez Rzeczpospolitą Polską członkostwa w Unii Europejskiej, dotyczą ogłoszenia tych aktów w Dzienniku Urzędowym Unii Europejskiej – wydanie specjalne.

³⁾ Zmiany wymienionej ustawy zostały ogłoszone w Dz. U. z 2001 r. Nr 154, poz. 1802, z 2002 r. Nr 135, poz. 1145 i Nr 166, poz. 1360, z 2003 r. Nr 208, poz. 2020 i Nr 223, poz. 2220 i 2221 oraz z 2004 r. Nr 42, poz. 386.

Załącznik do rozporządzenia Ministra Rolnictwa i Rozwoju Wsi
z dnia 15 kwietnia 2004 r. (poz. 663)

METODA ANALIZY ZAWARTOŚCI KWASU ERUKOWEGO W OLEJACH I TŁUSZCZACH PRZEZNACZONYCH DO SPOŻYCIA ORAZ W SKŁADNIKACH TŁUSZCZOWYCH LUB OLEJOWYCH ARTYKUŁÓW ROLNO-SPOŻYWCZYCH

Wymagania ogólne

l. Przygotowanie próbek

Masa próbki dostarczonej do laboratorium w celu przeprowadzenia analizy powinna wynosić 50 g, o ile nie jest wymagana większa ilość. Przed poddaniem analizie próbka musi być zhomogenizowana. Tak przygotowaną próbkę przechowuje się w szczelnych pojemnikach, bez dostępu powietrza i wilgoci.

II. Odczynniki

1) woda

Odczynnikiem do przeprowadzenia analizy jest woda.

W przypadku gdy w analizie wymagana jest woda jako rozpuszczalnik, do rozcieńczania lub do płukania, należy używać wody destylowanej lub demineralizowanej o przynajmniej równoważnej czystości.

Jeżeli w opisie metody analizy jest mowa o „rozpuszczeniu” lub „rozcieńczeniu” bez sprecyzowania żadnych innych odczynników, należy przez to rozumieć rozpuszczenie lub rozcieńczenie w wodzie. 

2) inne odczynniki

Wszystkie używane związki chemiczne powinny być o uznanej czystości analitycznej, o ile nie zaznaczono inaczej.

III. Aparatura

W wykazie aparatury znajdują się tylko pozycje o specjalistycznym przeznaczeniu i zgodnie ze specyfikacją metody.

W celu przeprowadzenia analizy należy stosować wagę analityczną o dokładności minimum 0,1 mg.

IV. Wyrażanie wyników

Wyniki, które przedstawia się w oficjalnym raporcie z analizy, powinny być średnimi wartościami, uzyskanymi z nie mniej niż dwóch oznaczeń, których powtarzalność jest określona w części Oznaczanie kwasu erukowego w dziale VII pkt 5.

Procentową zawartość wyraża się, o ile nie zaznaczono inaczej, jako procentowy (m/m) udział C 22:1 do wszystkich kwasów tłuszczowych w próbce przekazanej do laboratorium.

Liczba cyfr znaczących w tak przedstawionym wyniku powinna zależeć od dokładności stosowanej metody.

Oznaczanie kwasu erukowego

l. Zakres i obszar stosowania

Poniższa metoda stosowana jest do oznaczania kwasu erukowego w:

1) olejach i tłuszczach roślinnych i zwierzęcych zawierających kwas cetoleinowy (specyficzny cis-izomer kwasu dokozenowego występujący w olejach rybich) i

2) utwardzonych olejach i tłuszczach roślinnych i zwierzęcych zawierających trans i cis-izomery kwasu dokozenowego,

jeżeli całkowita zawartość kwasów dokozenowych lub całkowita zawartość kwasów cis-dokozenowych przekracza 5 % zawartości wszystkich kwasów tłuszczowych w tłuszczu. W innych przypadkach zawartość kwasów dokozenowych lub kwasów cis-dokozenowych oznacza się metodą określoną w Polskiej Normie PN-EN ISO 5508:1996 Oleje i tłuszcze roślinne oraz zwierzęce. Analiza estrów metylowych kwasów tłuszczowych metodą chromatografii gazowej.

II. Definicja

Zawartość kwasu erukowego w rozumieniu rozporządzenia oznacza zawartość tego kwasu otrzymaną w wyniku stosowania metody analizy, określonej w dziale VI.

III. Zasada

Estry metylowe otrzymane z kwasów tłuszczowych wchodzących w skład roślinnych i zwierzęcych olejów i tłuszczów są rozdzielane przy pomocy niskotemperaturowej chromatografii cienkowarstwowej na płytkach z żelem krzemionkowym z azotanem srebra i ilościowo oznaczane metodą chromatografii gazowej.

IV. Odczynniki

Do oznaczania kwasu eurkowego stosuje się następujące odczynniki:

1) eter dwuetylowy wolny od nadtlenków, świeżo destylowany;

2) n-heksan;

3) żel krzemionkowy G, którego należy używać do chromatografii cienkowarstwowej;

4) żel krzemionkowy, którego należy używać do chromatografii kolumnowej;

5) roztwór azotanu srebra, 200 g/l, przygotowany w następujący sposób: rozpuszcza się 24 g azotanu srebra w wodzie i uzupełnia wodą do objętości 120 ml;

6) roztwór estru metylowego „kwasu erukowego 5 mg/ml, przygotowany w następujący sposób: rozpuszcza się 50 mg estru metylowego kwasu erukowego w kilku ml n-heksanu i uzupełnia n-heksanem do objętości 10 ml;

7) tetrakozan metylu (standard wewnętrzny), 0,25 mg/ml, przygotowany w następujący sposób: rozpuszcza się 25 mg tetrakozanu metylu w kilku ml n-heksanu i uzupełnia n-heksanem do objętości 100 ml;

8) układ rozwijający. Toluen: n-heksan w proporcji 90:100 (v/v);

9) roztwór 2,7 dichlorofluoresceiny 0,5 g/l, przygotowany w następujący sposób: rozpuszcza się przy jednoczesnym ogrzewaniu i mieszaniu 50 mg 2,7 dichlorofluoresceiny w 100 ml 50 % wodnego roztworu metanolu.

V. Aparatura

1. Zestaw do chromatografii cienkowarstwowej powinien zawierać, w szczególności:

1) zamrażarkę do głębokiego mrożenia, odpowiednią do przechowywania komory rozwijającej i jej zawartości w temperaturze od minus 20° do minus 25 °C;

2) płytki do chromatografii cienkowarstwowej o wymiarach 200 mm x 200 mm;

3) lampę ultrafioletową;

4) szklane kolumny, długości około 200 mm, o wewnętrznej średnicy około 10 mm z filtrem z waty szklanej lub spiekiem szklanym. Alternatywnie można stosować małe rozdzielacze z filtrem ze spiekiem szklanym;

5) aplikator, do nanoszenia roztworów na płytki do chromatografii cienkowarstwowej w formie wąskiego pasma.

2. Chromatograf gazowy wraz z integratorem, który używa się w sposób określony w Polskiej Normie PN–EN ISO 5508:1996 Oleje i tłuszcze roślinne oraz zwierzęce. Analiza estrów metylowych kwasów tłuszczowych metodą chromatografii gazowej.

VI. Wykonanie oznaczenia

1. Przygotowanie estrów metylowych kwasów tłuszczowych

Pobiera się około 400 mg olejowego lub tłuszczowego składnika próbki do analizy i przygotowuje roztwór zawierający około 20 do 50 mg/ml estrów metylowych kwasów tłuszczowych w n-heksanie, zgodnie z procedurą określoną w Polskiej Normie PN-EN ISO 5508:1996 Oleje i tłuszcze roślinne oraz zwierzęce. Analiza estrów metylowych kwasów tłuszczowych metodą chromatografii gazowej.

2. Chomatografia cienkowarstwowa

1) przygotowanie płytek

W 500 ml kolbie stożkowej umieszcza się 60 g żelu krzemionkowego G, dodaje 120 ml roztworu azotanu srebra, przygotowanego w sposób określony w dziale IV pkt 5, i wytrząsa przez minutę, aby otrzymać całkowicie jednorodną masę.

Przygotowaną masą równomiernie pokrywa się płytkę, grubość warstwy powinna wynosić około 0,5 mm. Ta ilość masy jest wystarczająca do przygotowania pięciu płytek o wymiarach 200 mm x 200 mm.

Wstępnie suszy się płytki na powietrzu (najlepiej pozostawiając je bez dostępu światła przez około 30 minut). Całkowicie suszy się i aktywuje płytki, umieszczając je w suszarce o temperaturze 100 °C ą2 °C przez 2,5 godziny. Po zaktywowaniu zużywa się płytki jak najszybciej lub ostrożnie przechowuje w specjalnej szafce do przechowywania płytek chromatograficznych bez dostępu światła, następnie ponownie aktywuje się przed użyciem. Aktywacja w 110 °C przez godzinę może okazać się wystarczająca, o ile płytki nie ciemnieją w wyniku tego procesu. Przed użyciem zaznacza się linię w warstwie złoża w odległości 10 mm od bocznych i górnych krawędzi każdej płytki w celu zredukowania wpływu krawędzi podczas rozwijania.

2) nanoszenie estrów metylowych

Przy pomocy aplikatora, spełniającego warunki określone w dziale V ust. 1 pkt 5, nanosi się 50 μl roztworu estrów metylowych, określonego w ust. 1, przygotowanego z próbki, wąskim pasmem o długości około 50 mm, co najmniej 40 mm od bocznych krawędzi i 10 mm od dolnej krawędzi płytki. W ten sam sposób nanosi się 100 μl roztworu zawierającego równe objętości przygotowanego roztworu estrów metylowych, określonego w ust. 1 i roztworu estru metylowego kwasu erukowego, przygotowanego w sposób określony w dziale IV pkt 6. Roztwory należy nanosić ze szczególną ostrożnością ze względu na delikatność pokrycia. Jeśli potrzeba, można nanieść na płytkę 50 μl roztworu eruczanu metylu, przygotowanego w sposób określony w dziale IV pkt 6, w celu ułatwienia identyfikacji prążka tego estru po rozwinięciu. Po naniesieniu estrów metylowych wstawia się płytkę dolną krawędzią do eteru etylowego, dopóki eter nie osiągnie wysokości około 5 mm powyżej miejsca naniesienia próbki. To koncentruje estry etylowe w wąskim paśmie.

3) rozwijanie płytek

Układ rozwijający, spełniający warunki, o których mowa w dziale IV pkt 8, wlewa się do komory chromatograficznej na wysokość około 5 mm, przykrywa pokrywą i umieszcza w pojemniku zamrażarki, spełniającej warunki określone w dziale V ust. 1 pkt 1, o temperaturze –25 °C, lub w temperaturze jak najbardziej do niej zbliżonej (w niektórych przypadkach korzystne może być wyściełanie naczynia bibułą filtracyjną). Pod dwóch godzinach płytkę ostrożnie umieszcza się w komorze chromatograficznej i pozwala, aby rozpuszczalnik osiągnął wysokość około połowy lub dwóch trzecich wysokości płytki. Płytkę wyjmuje się i delikatnie odparowuje rozpuszczalnik w strumieniu azotu pod wciągiem. Ponownie umieszcza się płytkę w komorze, pozwala się, aby rozpuszczalnik osiągnął górną krawędź płytki. Płytkę wyjmuje się i, jak poprzednio, suszy w strumieniu azotu, następnie ostrożnie spryskuje roztworem 2,7 dichlorofluoresceiny przygotowanego w sposób określony w dziale IV pkt 9.

Płytkę ogląda się w świetle ultrafioletowym i lokalizuje pasmo zawierające eruczan metylu w badanej próbce poprzez odniesienie do wzmocnionego pasma w próbce, do której dodano eruczan metylu.

4) rozdzielanie frakcji estrów metylowych

Ostrożnie zeskrobuje się pasmo eruczanu metylu uzyskane z badanej próbki do 50 ml zlewki, unikając strat. W ten sam sposób przenosi się warstwę żelu krzemionkowego umieszczoną nad i pod pasmem estrów metylowych do drugiej 50 ml zlewki. To pasmo będzie zawierać frakcje wszystkich innych estrów metylowych kwasów tłuszczowych. Do każdej zlewki dodaje się 1,0 ml standardowego roztworu tetrakozanu metylu, przygotowanego w sposób określony w dziale IV pkt 7, i 10 ml eteru dwuetylowego, wolnego od nadtlenków, świeżo destylowanego. Miesza się i przenosi zawartość zlewek do rozdziału na oddzielnych kolumnach lub rozdzielaczach, określonych w dziale V ust. 1 pkt 4 zawierających około 1 g żelu krzemionkowego, używanego do chromatografii kolumnowej; eluuje się estry metylowe używając trzech lub czterech 10 ml porcji eteru dwuetylowego. Filtraty zbiera się do małych kolb okrogłodennych lub gruszkowych o stożkowym dnie. Każdy filtrat odparowuje się do małej objętości, używając łagodnego strumienia azotu. Estry metylowe przenosi się do małych szklanych probówek o stożkowym dnie. Rozpuszczalnik usuwa się przez odparowanie w strumieniu azotu tak, aby estry metylowe koncentrowały się na dnie probówek. Estry metylowe rozpuszcza się w około 25–50 ml n-heksanu.

5) Po przeprowadzeniu badań uzyskuje się typowy chrmatogram cienkowarstwowy pokazujący rozdział estrów metylowych kwasu erukowego, kwasu cetoleinowego i trans–izomerów kwasu dokozenowego, według wzoru:

3. Chromatografia gaz-ciecz

1) postępując zgodnie z procedurą określoną w Polskiej Normie PN-EN ISO 5508:1996 Oleje i tłuszcze roślinne oraz zwierzęce. Analiza estrów metylowych kwasów tłuszczowych metodą chromatografii gazowej, analizuje się 1–2 ml roztworów estrów metylowych uzyskanych z frakcji zawierającej eruczan metylu, określonej w pkt 2 lit. a i frakcji zawierającej pozostałe estry metylowe kwasów tłuszczowych, określonej w pkt 2 lit. b;

2) przy pomocy integratora otrzymuje się następujące powierzchnie pików:

a) z chromatogramu frakcji zawierającej eruczan metylu:

– powierzchnię piku eruczanu metylu (E),

– powierzchnię piku standardu wewnętrznego (L₁),

– całkowitą powierzchnię wszystkich pików estrów metylowych z wyłączeniem powierzchni piku standardu wewnętrznego (EF),

b) z chromatogramu frakcji zawierającej pozostałe estry metylowe kwasów tłuszczowych:

– całkowitą powierzchnię wszystkich pików estrów metylowych z wyłączeniem powierzchni piku standardu wewnętrznego (RF),

– powierzchnię piku standardu wewnętrznego (L₂).

VII. Obliczanie wyników

Metoda obliczania i wzór

1) zawartość kwasu erukowego w badanej próbce, wyrażona jako procentowy udział jego estru metylowego w całkowitej zawartości estrów metylowych kwasów tłuszczowych, otrzymanych z próbki, jest określona przez:

gdzie E, EF, RF, L₁ i L₂ są powierzchniami pików opisanymi w dziale VI ust. 3 pkt 2, skorygowanymi, jeżeli jest to konieczne, za pomocą współczynników kalibracyjnych.

Dla celów praktycznych wartość eruczanu metylu obliczona za pomocą powyższego wzoru jest równoważna zawartości kwasu erukowego wyrażonej jako procent całkowitej zawartości kwasów tłuszczowych w próbce.

2) jeżeli powierzchnie pików są wyrażone w procentach, to wartości EF i RF mogą być obliczone w następujący sposób:

EF = 100 – L₁

RF = 100 – L₂

3) metoda obliczania, określona w pkt 1 zakłada, że zawartość kwasu tetrakozanowego w próbce jest nieistotna. Jeżeli znacząca ilość kwasu tetrakozanowego jest obecna w próbce, to ilość tego kwasu (L₂) otrzymaną z chromatogramu frakcji zawierającej pozostałe estry metylowe kwasów tłuszczowych należy zredukować do:

L₂ – T₂

T₂ – powierzchnia piku tetrakozanu metylu pochodząca z próbki, która tworzy część powierzchni piku przypisanego do wzorca wewnętrznego na chromatogramie z frakcji zawierającej pozostałe estry metylowe kwasów tłuszczowych,

P₂ – powierzchnia piku palmitynianu metylu otrzymana z chromatogramu frakcji zawierającej pozostałe estry metylowe kwasów tłuszczowych,

T₀ – powierzchnia piku tetrakozanu metylu uzyskana z chromatogramu estrów metylowych wszystkich kwasów tłuszczowych,

P₀ – powierzchnia piku palmitynianu metylowego uzyskana z chromatogramu estrów metylowych całkowitej ilości kwasów tłuszczowych.

4) wyprowadzenie wzoru

Proporcję kwasów tłuszczowych we frakcji zawierającej eruczan metylu, wyrażoną jako procentową zawartość wszystkich kwasów tłuszczowych w próbce, określa się w następujący sposób:

Proporcję kwasu erukowego we frakcji zawierającej eruczan metylu, wyraża się jako

Zawartość kwasu erukowego w próbce, wyrażoną jako procentowy udział we wszystkich kwasach tłuszczowych, określa się jako:

5) powtarzalność

Różnica między wynikami dwóch oznaczeń przeprowadzonych jednocześnie lub w krótkim odstępie czasu na tej samej próbce, przez tego samego analityka, w tych samych warunkach, nie powinna przekraczać 10 % wyniku lub 0,5 g na 100 g próbki, biorąc pod uwagę wyższą wartość.